Kultur Jaringan

Suatu metode untuk mengisolasi bagian tanaman (protoplasma, sel, jaringan & organ) pada medium buatan secara aseptik & akan beregenerasi menjadi tanaman lengkap (TEORI TOTIPOTENSI SEL : Schleiden & Schwan, 1838).

SEJARAH
1902 : HABERLANDT (titik awal perkembangan kultur jaringan)
1904 : HANNING (kultur embrio diluar biji dalam medium buatan
1934 : WHITE (mengisolasi & menumbuhkan ujung akar tomat dlm suatu media yg mgd garam, mineral, esktrak ragi & sukrosa)


1934 : GAUTHERET (kultur kalus pada tan. Willow)
1954 : SKOOG (differensiasi kalus tembakau )
1969 : NITSCH & NITSCH (memperoleh tan. haploid dari kultur serbuk sari)
1971 : TAKABE (regenerasi protoplasma tembakau menjadi tan. Lengkap)

BEBERAPA ASPEK PENERAPAN KULTUR JARINGAN

1. perbanyakan tan. yg mempunyai nilai ekonomis tinggi 
2. memproduksi bahan-bahan farmasi & produk alami lainnya 
3. perbaikan sifat genetik tan. 
4. memperoleh tan. yg bebas penyakit 
5. memelihara kelangsungan plasma nutfah 

PERANAN KULTUR JARINGAN DALAM BIDANG PEMULIAAN TANAMAN

1. hibridisasi somatik
2. seleksi keragaman mutagen pada tingkat seluler
3. manipulasi ploidi
4. kombinasi seksual yang tidak dibatasi inkompatibitas
5. transfer DNA
6. perbaikan genetik tan. 

PERANAN KULULTUR JARINGAN DALAM PERBANYAKAN MIKRO

1. perbanyakan tan. dlm waktu singkat
2. penyediaan bibit bebas penyakit
3. mempertahankan genotipe yang spesifik
4. siklus pendek
5. tidak bergantung musim
6. membutuhkan ruang penyimpanan kecil & mempermudah pengangkutan 

Kultur Jaringan sangat perlu untuk tanaman yang :
1. Persentase perkecambahan biji rendah
2. Tanaman hibrida yang berasal dari tetua yang tidak menunjukkan male sterility
3. Hibrida-hibrida yang unik
4. perbanyakan pohon-pohon elite dan atau pohon untuk batang bawah
5. Tanaman yang selalu diperbanyak secara vegetatif spt : kentang, pisang, strawberry dsb.

Terminologi

• Kultur organ : kultur yang diinisiasi dari organ tanaman : ujung akar, pucuk aksilar, daun, bunga, buah muda dsb
• Kultur kalus : kultur sekumpulan sel yang tidak terorganisir, hanya sel-sel parenkim yang berasal dari berbagai bahan awal
• Kultur suspensi : kultur sel bebas atau agregat sel kecil dalam media cair dengan pengocokan, pada umumnya diinisiasi dari kalus
• Kultur protoplasma : sel-sel muda yang diinisiasi dalam media cair kemudian dihilangkan dinding selnya dg menggunakan enzim, protoplasma kmdn dibiarkan membelah diri dan membentuk dinding kembali pada media padat. Kultur protoplasma digunakan untuk hibridisasi somatik (fusi 2 protoplasma baik intra spesifik maupun interspesifik)
• Kultur haploid : kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman yi : kepala sari atau tepung sarinya. Kultur anther : kultur yang diinisiasi dari seluruh kepala sari
• Eksplan : bagian dari tanaman yg digunakan sbg bhn utk inisiasi suatu kultur
• Subkultur : Pemindahan kultur ke media lain baik media yg sama maupun yg lain
• Passage : masa/waktu inkubasi
• Inokulum : bhn yg diambil pd setiap subkultur
• Organogenesis : proses terbentuknya organ-organ : pucuk dan akar
• Embriogenesis : proses terbentuknya embrio somatik, embrio yg terbentuk bukan dr zigot ttp dari sel tubuh tanaman (somatik)
• Androgenesis : pembentukan embrio dari kultur anther (mikrospora)
• Gynogenesis : pembentukan embrio dari ovary yg blm mengalami fertilisasi
• Plantlet : tanaman lengkap hasil regenerasi dlm kuljar
• Aklimatisasi : masa adaptasi plantlet dari kultur yg heterotropik menjadi autotropik (membuat mknan sendiri)
• Kultur yg axenik : kultur dg hanya satu macam organisme yg diinginkan

TEKNIK ASEPTIK
PENYEBAB KONTAMINASI :

1. eksplan 
2. organisme kecil yg masuk kedalam media, botol kultur, alat tanam yg kurang steril 
3. lingkungan kerja & ruang kultur yg kotor 
4. kecerobohan dalam pelaksanaan 

Sterilisasi meliputi :
1. Sterilisasi lingkungan kerja
2. Sterilisasi alat-alat dan media
3. Sterilisasi bahan tanaman

Tingkat kontaminasi bhn tanaman tgt : 

1. Jenis tanaman 
2. Bagian tnm yg dipergunakan 
3. Morfologi permukaan (mis : berbulu) 
4. Lingkungan tumbuh (green house, lapangan) 
5. Musim wkt mengambil eksplan 
6. Umur tnm : seedling, tnm dewasa 
7. Kondisi tnm : sakit, sehat 

Bahan-bahan utk Sterilisasi eksplan : Kalsium hipoklorit; Natrium hipoklorit; Hidrogen peroksida; Gas klorin; Perak nitrat; Merkuri klorid; Betadine; Fungisida : Benlate; Antibiotik : kanamycin, streptomicyn; Alkohol

PERSYARATAN KEBERHASILAN :

1. tipe eksplan 
2. tipe media 
3. zat pengatur tumbuh 
4. lingkungan tumbuh 

EKSPLAN : bagian tanaman yang digunakan sbg bhn untuk inisiasi suatu kultur
JENIS :bergantung pada metode kuljar yg digunakan(organ, kalus, suspensi, protoplasma, meristem, embrio dll)
FAKTOR YANG MENENTUKAN LAJU PENINGKATAN DARI KUALITAS TAN. YG DIREGENERASIKAN
1. sumber eksplan
2. ukuran eksplan
3. perlakuan sblm dikulturkan
4. umur jaringan muda lebih banyak yang berhasil daripada jar. tua

MEDIA KULTUR
KOMPOSISI :

1. garam anorganik : 
2. makro essensial : C,H,O,N,S,P,K, & Mg, mikro : Fe,Mn,Zn, B, Cu, & Mo 
3. vitamin (thiamin, inositol, as. nikotinik, glisin, & piridoksin 
4. zat pengatur tumbuh (auksin & sitokinin), konsentrasi tgt jenis tanaman dan tujuan kultur 
5. Gula 
6. Bahan pemadat : agar 

Asam amino dan N organik

1. Persenyawaan kompleks alamiah (sering digunakan) ; air kelapa, ekstrak ragi, juice tomat, ekstrak kentang, pisang dll). 
2. Buffer : buffer organik 
3. Arang aktif : untuk menstimulir pertumbuhan akar 

ZAT PENGATUR TUMBUH 

Terutama : auksin dan sitokinin
ZPT mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan dan organ
Interaksi dan perimbangan antara ZPT yg diberikan (eksogen) dlm media dan ZPT endogen (yg ada dlm tnm) menentukan arah perkembangan kultur.
Auksin>sitokinin : akar
Auksin<sitokinin : tunas

Jenis-jenis Media :
Ø Media Murashige & Skoog (MS) : kebanyakan tanaman
Ø Media B5 (Gamborg dkk.) : suspensi kedelai
Ø Media Schenk & Hilderbrant (SH) : monokotil & dikotil
Ø Media WPM (Woody Plant Medium) : tan berkayu
Ø Media Vacint & Went : anggrek

AUKSIN
Merangsang pertumbuhan kalus, suspensi sel, dan organ’
Jenis dan konsentrasi tgt :
1. tipe pertumbuhan yg dikehendaki
2. Level auksin endogen
3. Kemampuan jaringan mensintesa auksin
4. Golongan ZPT lain yg ditambahkan
Auksin alami : IAA (Indole Acetis Acid)
Auksin sintetik : IAA; 2,4 D (2,4 dichlorophenoxy acetic acid); NAA (Naptaleine Acetic Acid); IBA (Indole Butyric Acid); NOA (Naphtoxy Acetic Acid); Picloram; Dicamba; Sitokinin; Penting dlm pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis
Jenis-jenis sitokinin : Kinetin; Zeatin; ZiP ; BAP (6-benzyl amino purine); Thidiazuron

LINGKUNGAN TUMBUH
cahaya : 1000 – 10.000 lux
temperatur : 24 oc – 28oc

PROSPEK KULTUR JARINGAN
TEKNIK/METODE BARU DALAM PERBANYAKAN TAN :
Ø ANGGREK
Ø TAN. HIAS & HORTIKULTURA
Ø LAINNYA
Ø TAN. KEHUTANAN

KEGIATAN KULJAR DI LABORATORIUM

1. persiapan, baik persiapan media maupun bahan tan. 
2. Isolasi bahan tanaman (eksplan) 
3. Sterilisasi eksplan 
4. Inokulasi eksplan (penanaman) 
5. inkubasi & penyimpanan kultur 
6. Aklimatisasi dan pemindahan ke lapang 

PEMBAGIAN RUANG LAB. KULTUR JARINGAN TAHAPAN KEGIATAN PEMBUATAN MEDIA
I. PEMBUATAN LARUTAN STOK 

- menghemat pekerjaan membagi bahan berulang-ulang 
- lar.stok yang siap digunakan dpt disimpan asal diletakkan di tempat bertemperatur rendah (kulkas) pembuatan lar. stok - -- sesuai dgn kelompok (makro, mikro, NaFeEdta, vit, zpt ) 

MULTIPLIKASI
TUJUAN : perbanyakan pucuk/tunas/klon tan. & meningkatkan terjadinya percabangan aksial & pembentukan pucuk secara adventif
MAKSUD : memindahkan tunas-tunas dari dalam wadah kultur secara septik yang tumbuh dari hasil induksi & ditanam lagi dalam botol kultur lain yang berisi media & hormon yang mampu merangsang pertunasan
PENGAKARAN
Tujuan : pembentukan akar & pembentukan plantlet mandiri hingga menjadi tan. sempurna & bertahan hidup dipindahkan dari lingkungan in vitro ke lingkungan luar

PERLAKUAN PENGAKARAN

1. modifikasi hormon perakaran 
2. penggunaan arang aktif 
3. modifikasi lingkungan tumbuh 

AKLIMATISASI

1. membersihkan agar-agar dari perakaran tan. dgn pencucian di air mengalir 
2. utk lebih merangsang akarnya dapat dengan mencelupkannya kedalam lar. hormon 
3. tan. dipindahkan pada media tanam yang steril, disiram & disungkup plastik --------- menjaga kelembaban 
4. suhu lingkungan berkisar 18-21oc & disiram terus 
5. setelah tan. kuat terhadap sinar matahari, sungkup dapat dibuka.